{"created":"2023-05-15T14:23:41.349492+00:00","id":4719,"links":{},"metadata":{"_buckets":{"deposit":"cb6cc152-fc1c-41f8-95b4-14e40d1807d7"},"_deposit":{"created_by":15,"id":"4719","owners":[15],"pid":{"revision_id":0,"type":"depid","value":"4719"},"status":"published"},"_oai":{"id":"oai:glim-re.repo.nii.ac.jp:00004719","sets":["1253:135:136:1296"]},"author_link":["46941","46942"],"item_10006_date_granted_44":{"attribute_name":"学位授与年月日","attribute_value_mlt":[{"subitem_dategranted":"2019-03-09"}]},"item_10006_degree_grantor_42":{"attribute_name":"学位授与機関","attribute_value_mlt":[{"subitem_degreegrantor":[{"subitem_degreegrantor_language":"ja","subitem_degreegrantor_name":"学習院大学"}],"subitem_degreegrantor_identifier":[{"subitem_degreegrantor_identifier_name":"32606","subitem_degreegrantor_identifier_scheme":"kakenhi"}]}]},"item_10006_degree_grantor_49":{"attribute_name":"学位授与機関(英)","attribute_value_mlt":[{"subitem_degreegrantor":[{"subitem_degreegrantor_language":"en","subitem_degreegrantor_name":"Gakushuin 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Sulfate存在下で10日間連続培養後、その生え抜きを選抜した。Pendrin発現とサリチル酸応答性を確認した後、これらを96well培養プレートで1細胞/1wellに限界希釈し、シングルコロニー由来の単クローンを得た。得られた単クローン細胞を再度、Pendrin発現・サリチル酸応答性の確認後、細胞のクローニング操作を合計2回行った。このようにして、野生型Pendrin発現細胞(Wt)と変異型Pendrin(P123S)発現細胞(PH1-1H1)を得たことで、遺伝子導入の段階を省くことが可能となり、第三章のMorphology解析に有用な細胞株であると判断した。\n\n第三章ではCellInsightTMを用いて細胞のMorphology解析のためのパラメーターを検討した。　\n　変異型Pendrin(P123S)は細胞質に集積し、野生型Pendrin(Wt)は細胞膜に局在する。一方、10 mMサリチル酸を加えることで改善し、Pendrinの細胞膜局在が上昇し細胞質局在は減少する。この局在変化について、従来の手法では、免疫染色の後共焦点レーザー顕微鏡にて得られた画像を画像解析ソフトFluoViewTMで取込し、細胞膜・細胞質の蛍光強度を無作為に100ポイント測定して評価していた。本研究では96well培養プレートを用いた迅速な薬剤スクリーニングを目的にこれを改良した。細胞イメージアナライザーCellInsightTMによる計測は、96well内を100フィールドに区分し、各フィールド内最大100個細胞を検出し、全細胞のタンパク質局在を網羅的に解析し蛍光強度を測定できる。そこで解析プログラムMorphology V4の解析パラメーターの検討を行った。複数の検討より、細胞の外周を解析の基準であるCh1とし、核をCh2とした。そしてCh1から内側へ5 pixel幅を細胞質Ch3(Cytoplasm:C)とし、Ch1から内側2 pixel幅を細胞膜(Plasma Membrane:M)Ch4とした。次にPH1-1H1細胞に対してサリチル酸による変異型Pendrin移行活性を評価した結果、Ch4(M)の上昇はみられなかったものの、サリチル酸濃度依存的Ch3(C)の減少を確認することができた。(Ch4は、細胞外周の微小な凹凸や輪郭の正確なトレースが困難で、また、背景の黒色領域も合わせて検出したため、正確な細胞膜の蛍光強度が検出できなかった。)　このことから、スクリーニングの基準を、Ch3(C)蛍光強度の減少として決定し、第四章のサリチル酸類縁体の移行活性スクリーニングに用いた。\n\n第四章では、サリチル酸類縁体による変異型Pendrin移行活性スクリーニングと候補化合物の探索を行った。\nサリチル酸とその類縁体は、96well培養プレート中PH1-1H1細胞に12時間添加し、免疫染色の後、第三章で確立したCellInsightTMによるMorphology V4でCh3を基準にスクリーニングした。その結果、化合物の濃度依存的にCh3(C)減少を示す6つの候補化合物を発見した。さらに、FluoViewTMによる詳細な蛍光強度の測定をし、細胞膜(Plasma Membrane:M) / 細胞質(Cytoplasm:C) = M/C比を調べた結果、サリチル酸は10 mMでM/C比が1.0であるのに比べ、M/C比が0.3 mMで1.5、0.1 mMで0.9を示す化合物(2-aminophenyl)methanolを見い出した(化合物番号8)。すなわち、化合物8はサリチル酸に対して活性がおよそ100倍高いことを示した。さらに、薬剤を培地から取り除いた後24時間までの細胞内薬剤持続性効果を検討した結果、サリチル酸は薬剤除去後6時間で効果が失われたのに対して、化合物8は12時間後まで効果が持続した。以上より、化合物8は変異型Pendrinに対して細胞膜移行活性を有する候補化合物であることが示唆された。\n\n本研究の結論\n1.限界希釈法による細胞のクローニングで、野生型Pendrin発現細胞(Wt)と変異型Pendrin(P123S)発現細胞(PH1-1H1)を得た。Wt細胞はG-418 Sulfate 存在下で恒常的に野生型Pendrinを発現し、細胞膜局在を示した。PH1-1H1細胞はG-418 Sulfate 存在下で恒常的に変異型Pendrinを発現し、細胞質に局在を示した。これに10 mMサリチル酸を12時間添加することで細胞膜局在を示した。得られたPH1-1H1細胞は、サリチル酸類縁体を用いた変異型Pendrin移行活性スクリーニングに有用な細胞である。\n2.CellInsightTMによるMorphology解析パラメーターの条件検討を行った。細胞外周を解析の基準であるCh1とし、Ch1より内側2 pixelから7 pixelの5 pixel幅を細胞質Ch3(Cytoplasm:C)として設定することで、サリチル酸濃度依存的なCh3(C)の減少が確認できた。すなわち、化合物濃度依存的なCh3(C)の減少に着目することで、96 well培養プレートを用いた迅速かつ網羅的な、変異型Pendrin移行活性スクリーニングが可能となった。\n3.変異型Pendrin移行活性スクリーニングより6つの有効な候補化合物を発見した。中でも化合物8 ((2-aminophenyl)methanol)はサリチル酸に対して細胞膜移行活性が100倍高く、加えて細胞内薬剤持続的効果も長く12時間を示した。すなわち、化合物8は変異型Pendrinの細胞膜移行活性を有する有用な候補化合物であることが示唆された。\n","subitem_description_type":"Abstract"}]},"item_10006_description_32":{"attribute_name":"フォーマット","attribute_value_mlt":[{"subitem_description":"application/pdf","subitem_description_type":"Other"}]},"item_10006_dissertation_number_45":{"attribute_name":"学位授与番号","attribute_value_mlt":[{"subitem_dissertationnumber":"32606乙第169号"}]},"item_10006_version_type_33":{"attribute_name":"著者版フラグ","attribute_value_mlt":[{"subitem_version_resource":"http://purl.org/coar/version/c_970fb48d4fbd8a85","subitem_version_type":"VoR"}]},"item_access_right":{"attribute_name":"アクセス権","attribute_value_mlt":[{"subitem_access_right":"open access","subitem_access_right_uri":"http://purl.org/coar/access_right/c_abf2"}]},"item_creator":{"attribute_name":"著者","attribute_type":"creator","attribute_value_mlt":[{"creatorNames":[{"creatorName":"鍋山, 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